兔抗RAP1抗体亲和纯化，即用型稳定配方RAP1抗体

RAP1Repressor/Activator Protein 1也称TERF2IP是端粒保护蛋白复合物“shelterin”的核心组分之一在端粒长度调控、重组抑制以及转录调节中发挥关键作用。针对RAP1的特异性抗体是研究端粒生物学、基因组稳定性及细胞衰老的重要工具。本文详细介绍由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗RAP1全长蛋白亲和纯化多克隆抗体货号A300-306A的技术参数、应用条件及实验要点为用户提供系统的操作参考。一、产品基本规格该抗体为兔多克隆抗体靶向人RAP1蛋白由TERF2IP基因编码GeneID 54386。反应性经测试为人源样本。抗体形式为完整IgG未偶联标记物亚型为IgG。采用重组全长人RAP1蛋白作为免疫原经抗原亲和纯化获得。抗体浓度为1000 µg/ml1 mg/ml保存于Tris-柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 7–8中含0.09%叠氮钠作为防腐剂。储存条件为2–8°C自收货之日起有效期为一年。注意事项缓冲液中含叠氮钠会抑制过氧化物酶活性。若后续检测涉及HRP标记二抗建议将一抗稀释至工作浓度后使用叠氮钠浓度被大幅稀释影响可忽略对于极高灵敏度的化学发光检测可通过透析或超滤去除叠氮钠。叠氮钠也具有毒性操作时需戴手套。二、免疫原与生产工艺抗体采用重组全长人RAP1蛋白参考序列NP_061848.2免疫兔子。该蛋白包含端粒结合因子TRF2相互作用区域以及Myb样结构域。免疫后获得的抗血清通过固相载体固定的RAP1蛋白进行亲和层析纯化特异性捕获识别天然或变性RAP1的IgG抗体。免疫球蛋白浓度依据比尔定律测定1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4。该工艺确保了抗体高特异性与低背景。三、推荐的实验应用与稀释条件以下应用及稀释度均经过验证或提供明确的起始范围。所有Western blot实验均使用5%脱脂牛奶-TBST作为封闭液和抗体稀释液一抗孵育过夜4°C或室温均可推荐4°C以提高信噪比。1. 蛋白质印迹Western Blot推荐稀释度1:2,000 – 1:10,000细胞裂解液WB使用山羊抗兔IgG重链轻链二抗推荐货号A120-101P免疫沉淀物WB需使用抗兔IgG轻链HRP标记二抗并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清货号S100-020。这一策略可避免检测时出现变性IgG重链约55 kDa的干扰条带尤其适用于分析RAP1分子量约65–70 kDa与其它蛋白的共沉淀。2. 免疫组织化学IHC推荐稀释度1:500 – 1:2,000抗原修复对于福尔马林固定、石蜡包埋FFPE组织切片推荐使用Tris-EDTA缓冲液pH 9.0进行热诱导抗原修复。可采用微波或高压修复方式95–100°C维持15–20分钟。相比于柠檬酸缓冲液pH 6.0碱性Tris-EDTA对核抗原RAP1的暴露效果更佳。封闭建议使用5%正常山羊血清或3% BSA封闭非特异性位点。3. 免疫沉淀IP推荐用量每毫克细胞裂解液使用6 µg抗体。裂解液蛋白浓度建议调整至1–5 mg/ml加入抗体后4°C旋转孵育2小时或过夜。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖珠捕获免疫复合物。洗涤步骤至少3–5次使用IP裂解缓冲液如含150 mM NaCl、0.5% NP-40的Tris缓冲液。四、靶点生物学背景RAP1也称TRF2相互作用蛋白1、DRIP5是端粒shelterin复合物的组成蛋白之一。Shelterin复合物包括TRF1、TRF2、POT1、TPP1、TIN2和RAP1共同保护端粒免受DNA损伤修复机制的误认。与其他组分不同RAP1对端粒“封帽”capping和非同源末端连接NHEJ的抑制并非必需其核心功能是负向调控端粒重组并抑制同源定向修复HDR。缺乏RAP1会导致端粒出现超长或重组异常进而影响基因组稳定性。此外RAP1还作为转录调节因子可在端粒外定位至基因启动子区参与代谢、炎症及氧化应激相关基因的表达调控。因此该抗体不仅适用于端粒生物学研究也适用于信号转导、衰老及肿瘤发生机制探索。五、产品性能特点1.全长蛋白免疫原相比于多肽免疫全长重组蛋白可产生识别多个表位的多克隆抗体提高对天然构象和翻译后修饰的识别能力。2.亲和纯化非特异性反应低WB中背景清晰。预期在HeLa、293T等细胞裂解液中检测到约65–70 kDa的主条带RAP1分子量约68 kDa。3.宽应用范围WB、IHC和IP三种应用均提供验证稀释度尤其IP用量明确6 µg/mg裂解液便于标准化操作。4.高稀释比WB稀释度最高达1:10,000IHC达1:2,000抗体经济性良好。5.稳定性2–8°C保存一年无需冷冻分装避免反复冻融导致的活性损失。六、储存与稳定性抗体原液于2–8°C避光保存切勿冷冻。冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。在推荐的缓冲液含叠氮钠防腐中抗体至少稳定一年。若需长期储存超过一年可无菌分装后冷冻于-20°C或-80°C但应避免反复冻融建议分装成单次用量。注意叠氮钠在冷冻条件下仍可抑菌。