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2025/12/29 14:06:09
在自身免疫性疾病的研究与诊疗中，免疫细胞的功能异质性是解析发病机制、评估治疗效果的核心难点。酶联免疫斑点（Elispot）技术平台（点击），以 “单细胞水平细胞因子分泌检测” 为核心特性，为风湿免疫科的自身免疫病研究提供了精准、高效的技术工具。本文将从技术原理、操作流程、核心优势出发，聚焦类风湿关节炎的研究场景，解析该技术的应用价值。
一、技术原理与背景：从群体检测到单细胞功能定位
Elispot 技术是将细胞培养与 ELISA 技术结合的前沿检测方法，其核心原理是通过 “双抗夹心” 体系捕获单细胞分泌的细胞因子（CK）：在 PVDF 板上预包被特异性单克隆抗体，待检测细胞受刺激后分泌的 CK 会被周围抗体捕获；洗去细胞后，加入生物素标记的二抗与酶标链霉亲和素，通过酶促显色反应使阳性细胞对应位置形成可见斑点，最终通过读板仪计数斑点数量，实现单细胞水平的功能定量。
传统免疫检测技术（如 ELISA）仅能获取细胞因子的总浓度，无法区分单个细胞的分泌能力；而乐备实 Elispot 技术平台通过优化抗体亲和力与显色体系，可精准标记每个分泌目标细胞因子的活性细胞，完美适配自身免疫病中 “低频率功能免疫细胞” 的检测需求。
| 技术维度 | Elispot 技术 | 传统 ELISA 技术 |
|---|---|---|
| 检测层面 | 单细胞水平（功能细胞频率 + 分泌能力） | 群体水平（细胞因子总浓度） |
| 灵敏度 | 百万分之一阳性细胞检出率 | 仅能检测 ng/mL 级蛋白，低丰度靶标易漏检 |
| 结果解读 | 斑点数 = 活性细胞数，直观区分细胞异质性 | 吸光度值 = 蛋白总量，无法区分细胞个体差异 |
| 功能反映 | 检测细胞受刺激后新分泌的细胞因子，反映活细胞功能 | 检测样本中已存在的蛋白，无法区分细胞活性 |
| 适用场景 | 低频率功能细胞检测、免疫应答机制解析 | 高丰度蛋白定量、大规模样本初筛 |
二、标准化技术操作：适配风湿免疫科样本特性
针对风湿免疫科常见样本（如外周血单个核细胞、滑膜液细胞），建立了标准化的 Elispot 实验流程，核心步骤如下：
- 板包被与封闭：将特异性捕获抗体稀释后加入 PVDF 板，4℃孵育过夜完成包被；次日用 PBST 洗涤后，加入封闭液室温封闭 1 小时，消除非特异性结合干扰。
- 细胞接种与刺激：分离样本中的靶细胞（如 T 细胞），调整浓度后接种至包被板，同时加入特异性抗原（如类风湿关节炎相关自身抗原瓜氨酸化蛋白）或刺激剂，37℃、5% CO₂培养箱孵育 18-24 小时，使细胞分泌的 CK 被抗体捕获。
- 检测与显色：弃去细胞与培养基，洗涤后加入生物素标记的检测抗体，室温孵育 2 小时；再加入碱性磷酸酶（ALP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，孵育后加入显色底物（如 BCIP/NBT），待斑点清晰后终止反应。
- 结果分析：使用乐备实 Elispot 读板仪扫描成像，通过软件自动计数斑点数量，计算分泌目标 CK 的细胞频率（斑点数 / 接种细胞数）。
三、核心技术优势：风湿免疫研究的差异化支撑
Elispot 技术平台针对自身免疫病研究需求，具备四大核心优势：
- 高灵敏度：可检出百万分之一频率的阳性细胞，灵敏度是 ELISA 的 200 倍，能精准捕获风湿免疫病中低丰度的自身反应性 T 细胞。
- 活细胞功能检测：捕获的是细胞受刺激后新分泌的 CK，真实反映细胞的功能活性，而非静态蛋白含量，更贴合体内免疫应答状态。
- 直观可信：单个阳性细胞对应一个斑点，斑点数量直接代表活性细胞数，斑点大小可反映细胞分泌能力的异质性，结果解读更直观。
- 高通量检测：采用 96 孔板体系，单日可完成数百个样本检测，仅需 45 毫升血液即可测试 600 种不同抗原的反应，适配大规模自身抗原筛选场景。
四、科室应用聚焦：助力风湿免疫科类风湿关节炎研究
类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜炎症、关节破坏为特征的自身免疫病，其核心机制是自身反应性 T 细胞异常活化，但传统技术难以精准解析这些细胞的功能特征。乐备实 Elispot 技术平台可针对性解决以下研究难题：
- 自身反应性 T 细胞的鉴定与定量：RA 的发病与瓜氨酸化蛋白特异性 T 细胞的活化密切相关，但这类细胞在体内频率极低。通过乐备实 Elispot 技术，可检测患者外周血或滑膜液中针对瓜氨酸化蛋白的 IFN-γ、IL-17 分泌型 T 细胞频率，明确自身反应性 T 细胞与疾病活动度的关联 —— 某三甲医院风湿免疫科的研究显示，RA 患者滑膜液中这类细胞频率是健康人的 8-12 倍，且与 DAS28 评分呈正相关。
- 治疗方案的疗效评估：传统 RA 治疗疗效评估依赖临床症状评分，缺乏客观的免疫功能指标。利用 Elispot 技术动态监测治疗前后自身反应性 T 细胞的频率变化，可早期评估药物（如 TNF-α 抑制剂）的免疫调节效果 —— 研究发现，治疗有效患者的 IFN-γ 分泌型 T 细胞频率在 2 周内下降 40% 以上，较临床评分提前 3-4 周提示疗效。
- 发病机制的解析：RA 滑膜炎症中存在 Th1/Th2/Th17 细胞的失衡，但传统方法难以区分不同亚群的功能。乐备实 Elispot 技术可同步检测多种细胞因子（如 IFN-γ 代表 Th1、IL-4 代表 Th2、IL-17 代表 Th17），明确不同 T 细胞亚群在 RA 中的作用 —— 研究证实，RA 患者滑膜液中 Th17 细胞频率显著升高，且其分泌的 IL-17 可促进滑膜成纤维细胞的增殖，为靶向 Th17 的治疗策略提供了实验依据。
原文点击：Elispot 技术平台：单细胞功能检测赋能风湿免疫科自身免疫病机制研究